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    FAQ

    2015-05-13 09:28:33 南京迪康金诺生物技术有限公司 阅读

    科研工作时使用测序公司的服务过程中,是否遇到这些问题? 

    • 公司出具的结题报告千篇一律,满篇的专业术语看不懂?
    • 把主要的成本花在了测序上,却要花更多的时间成本去解读数据?
    • 看懂了结题报告,却发现所有的文章都是一个思路,就连结论也很相似?
    • 一般的分析难以挖掘里面的有用信息,得到的信息很难发一篇可观的SCI
    • 把主要精力放在了实验设计上,等数据一出来才发现设计的并不合理?
    • 图片千篇一律,拉低了文章的档次?

      本篇FAQ也许能帮助您消除一些疑惑。

    服务相关

    1、如何挖掘测序数据里对研究可信息?

    2、为什么划分标准化服务和个性化服务?

    3、为什么个性化服务收费高?

    4、为什么要使用生物信息分析公司的服务?

    5、为什么优先选择本地的测序公司?

    6、为什么选择迪康金诺?

    7、迪康金诺提供的产品有哪些?

    8迪康金诺可以得到什么样的服务?

    转录组FAQ

    1.什么是转录组和转录组高通量测序?

    2. 转录组测序相比芯片等技术有何优势?

    3.转录组测序送样要求?

    4.是否需要生物学重复,一般重复几次较好?

    5. 一般依据什么指标进行差异表达基因筛选?

    6、差异表达基因有很多,如何选择自己想要的?

    7、常用的FPKMRPKM有何区别?

    8、转录组分析结果如何进行后续的实验验证?

    9、转录组测序多少数据量合适?

    LncRNA FAQ

    1. 什么是lncRNA?有何生物学功能?

    2. lncRNA研究主要集中在那些方面?

    3.lncRNA研究建库及测序方案是什么?

    4. lncRNA测序一般要多少数据量?

    5. lncRNA数据是否可以做mRNA的分析?

    6. lncRNA测序送样要求?

    miRNA FAQ

    1. miRNA测序样本要求?

    2. 为什么测序时会测到接头?

    3. miRNA分析时,客户需要提供哪些信息?

    4.该物种没有对应的基因组序列,是否可以分析?

    5. miRNA一般要求多少测序量较为理想?

    6. miRNA定量一般采用什么方法?

    7. 为什么分析结果会出现mRNArRNA以及tRNA等序列?

    表达谱FAQ

    1. 表达谱测序量一般要求多少?

    2. 是否需要生物学重复,一般重复几次较好?

    3. 无参考基因组能否进行表达谱分析?

    4.如何进行差异表达基因后续的功能分析?

    5. 如何选择差异表达基因进行后续验证?


    服务相关


    1、如何挖掘测序数据里对研究可信息?

      您需要在标准化分析的基础上,结合课题的研究目的进行针对性的个性化数据分析;

    2、为什么划分标准化服务和个性化服务? 

      标准化服务是使用标准化流程从测序数据中分离出基本的中间数据和统计信息,这些信息如何解读,如何进一步研究提供依据,必须与具体项目的研究目的相结合,在标准化服务产生数据的基础上由研究人员与生物信息分析师共同完成针对性的数据分析与解读,甚至需要多轮分子生物学-测序-生物信息学的迭代就是个性化分析。只有个性化分析才能根据研究者的研究目的、实验设计和预期结果或假设来采用合理的分析方法与工具,最终得出有意义的分析结果

      目前大多数测序公司提供的是标准化服务,用户获得的分析报告一般不足以支撑研究者得出科学研究的结论。

    3、为什么个性化服务收费高?

      个性化分析需要分析师投入更多的时间和精力来了解用户研究的背景、样本特征gene信息和新的分析方法等,这往往需要大量人力成本进行资料收集、文献阅读、工具调试、专用分析工具开发等工作,这都需要分析师提供全程一对一的服务此外,还包括由此带来的各种软硬件投入的成本,维护设备与软件更新的成本等;

    4、为什么要使用生物信息分析公司的服务?

      许多用户单位拥有较强的软硬件资源,从成本考虑会倾向于自行培养分析人员进行数据分析。但是生物信息分析工作仍然是一项具有较高技术门槛的工作,许多学校使用研究生进行数据分析,其培养成本不说,研究生的流动性也会使实际的人力成本大大提高,分析质量也得不到保障。生物信息公司一般拥有强大的专职信息分析队伍、IT维护团队和硬件资源,针对不同的测序项目也会划分不同的项目组以保证专业性。与一般的测序公司相比,我们更专注于RNA测序等分析领域,积累了丰富的分析经验,能提供更加专业个性化的数据分析服务,最重要的,我们主要面对本地市场以提供更完美的客户服务

    5、为什么优先选择本地的测序公司?

    科学研究的过程需要交流,交流的最佳方式是面对面;我们既可以提供用户派工作人员或研究生来公司协同分析工作,也可提供生物信息分析师上门汇报交流等服务。

    6、为什么选择迪康金诺?

    我们有最好的生物信息分析团队;

    我们有一流的测序服务合作公司;

    我们更专注于针对性地挖掘数据中对用户研究有用信息而非简单地跑流程

    我们拒绝复杂的沟通流程,我们要分析师与客户有直接有效的沟通;

    我们让客户参与到分析中来,了解数据的获得,得到您想要的结果;

    7、迪康金诺提供的产品有哪些?

    RNA类产品:转录组重测序、de novo测序;LncRNA测序;miRNA测序;表达谱测序;

    DNA类产品:基因组重测序、de novo测序;外显子组测序;

    表观类产品:ChIP-seq测序;

    8迪康金诺可以得到什么样的服务?

    专业化服务:专业的生物信息分析团队;更专注于数据的深入挖掘;紧跟国际最新研究进展;分析项目于算法流程第一时间更新。

    本地化服务:侧重于本地客户,提供上门服务和客户代表驻公司参与分析过程;定期为客户提供专业的培训,引导客户参与分析;提高沟通效率,提供分析师与客户面对面交流机会。

    个性化服务:专注于个性化分析,为客户提供量身定做的解决方案,重点解决客户疑难问题。

    其他服务:售前实验及分析方案设计;售后定期免费答疑;提供文章写作帮助;提供项目进展实时跟踪。

     


    转录组FAQ


    1.什么是转录组和转录组高通量测序?

    转录组是指细胞或组织在特定时间及特定状态下转录出来所有的RNA的总和,除编码蛋白的mRNA外,还包括大量的非编码RNA,比如:miRNArRNAtRNAlncRNA等;

    转录组高通量测序(Transcriptome High-throughputSequencing)是指采用最新的高通量测序技术对细胞或组织内的mRNA进行测序,依据物种是否有参考基因组,分为重测序和de novo测序两种。

    2. 转录组测序相比芯片等技术有何优势?

    转录组测序相比于芯片等技术主要有以下几种优势:

    1)信息量更多更全面:通量高,不仅可以对所有基因进行表达水平定量,同时还可以获得该基因的详细结构及序列信息,可以在更多角度比较不同组织或细胞的转录组变化;

    2)高灵敏度:可以检测稀有转录本,有利于发现新的gene

    3)高特异性:可以有效避免芯片非特异性杂交问题,降低背景噪声的影响,特别是随着测序长度的不断增加,特异性也不断提高;

    4)检测范围广:相比于芯片等技术,检测阈值更广,可以达到106数量级;

    5)可重复性好:建库及测序过程标准,具备很高的可重复性;

    6)适用范围广:适用于任何物种的研究,相比于芯片依赖已知序列设计特异的探针,该方法无需已知的基因序列信息,通过测序和组装可以直接获得该物种的转录组序列和表达信息;

    3.转录组测序送样要求?

    1、 Total RNA

    样品的量:总量2ug

    样品浓度:浓度100ng/ul

    样品纯度:OD260/2801.828S/18S1

    RNA完整性:植物、真菌 RIN6.5;动物 RIN7.0;原核 RIN6.0

    2、组织样本

    推荐用RNAlater solution  (LifeTech 公司出品)来保存用于RNA测序的组织样本。

    RNAlater solution 是一种水性的,无毒的组织保存试剂,它可以快速浸透组织并使细胞

    中的RNA得到保护、保持稳定。它减少了对样本进行立即处理或者深低温液氮冷藏的需

    求。 

    步骤:

    在得到新鲜样本之后,不少于1g,把样本立即剪切成小于0.5厘米的小块并浸在5倍体积的RNAlater solution (例如,对于0.5g的样本,要放在2.5mL RNAlater solution中)中。小的组织,例如大鼠的肾脏、肝脏和脾脏可以整个浸在RNAlater solution中。把样本在-20  

    或者-80长时间保存。

    3、培养的细胞

    推荐用TRIzol Reagent  (LifeTech 公司出品)来处理用于RNA测序的细胞样本。TRIzol Reagent 可以高效地抑制RNase酶的活性,从而保持RNA的完整性。 

    步骤: 

    对于培养在培养皿里的细胞,先去掉培养皿中的培养基。然后每10cm2的培养表面直接

    加入1mLTRIzol Reagent。例如:对于一个35mm的培养皿加1mLTRIzol Reagent,对于60mm的培养皿加3mLTRIzol Reagent,对于100mm 的培养皿加8mLTRIzol Reagent 。在培养皿中直接上下吹打细胞几次,以使细胞裂解。把样本保存在-80。 

    对于悬浮的细胞,用离心的方法收集细胞并去掉培养基。然后对每0.25mL样本(1*107个细胞)加入0.75mLTRIzol Reagent。再上下吹打几次,以使细胞裂解。可以用匀浆器来破碎酵母和细菌细胞。把样本保存在-80

    4.是否需要生物学重复,一般重复几次较好?

    建议2~3次,结合分析需求和预算,可以考虑更多次的重复。从目前发表的文章来看,设置生物学重复,有利于提高检测结果的准确性,增加研究结果的影响力;

    5. 一般依据什么指标进行差异表达基因筛选?

    从目前发表的文章和一些常用的软件来看,进行差异基因筛选主要依赖以下两个指标:

    1)差异倍数(fold change):相同基因在不同样本(组)中表达水平差异倍数,如:FC≥2FC≤0.5

    2corrected p-valueFDR:一般选取≤0.05作为显著差异表达基因,该值越小,则差异越显著;

    结合自己的研究目的,可以适当调整上述两个指标,可以选取更小的corrected p-valueFDR以及更大的差异倍数,筛选出更为显著的差异表达基因。

    6、差异表达基因有很多,如何选择自己想要的?

    大多数老师会遇到这样的问题,如何在众多的基因中,筛选出自己的目的基因。一般来说,首先需要结合项目的研究目的及生物学意义,来筛选相关的功能的基因,比如所关注的某代谢或信号转导途径相关基因。另外,可以结合差异表达基因的功能富集性分析结果来筛选,基于差异表达基因富集的功能类以及代谢、信号转导途径获得有意义的基因。

    7、常用的FPKMRPKM有何区别?

    FPKM表示每百万比对片段中比对到转录本每千个碱基的数量,RPKM表示每百万reads中比对到转录本每千个碱基的数量,从发表的文章来看,两种方法均被广泛采用,当测序为单端(SE)测序时,两种方法相同,当双端(PE)测序时,每个插入片段将产生两条readsFPKM统计的是测序插入片段,RPKM统计的是每条readsPE reads在比对过程中,会出现一端比对上,一端比不上情况,这使得两种方法对于基因表达定量出现一些小的差异,但是一般不会影响差异分析结果。

    8、转录组分析结果如何进行后续的实验验证?

    差异表达基因可以直接采用qRT-PCR的方法验证,此外转录组分析的可变剪接、融合基因SNPRNA编辑、新转录本等,可以采用PCR结合Sanger测序的方法进行验证。

    9、转录组测序多少数据量合适?

    测序量的大小主要与研究的目的有关,转录组测序一般除表达定量外,还对可变剪接、SNP、新转录本以及融合基因等进行研究,为提高检测的灵敏度和准确性,一般要求较高的测序深度,我们一般推荐5G以上的clean data,如果重点关注融合基因或者一些表达相对较低的基因(LncRNA等)推荐使用8~10Gclean data

    没有没有参考基因组,进行de novo组装,为了保证尽可能的组装出完整的转录本以及低表达的转录本,建议10G或以上的clean data

     


    LncRNA FAQ


    1. 什么是lncRNA?有何生物学功能?

    研究表明,基因组序列的5~10%的区域被稳定转录,蛋白质编码基因仅为1%,其余序列为非编码RNAlncRNA一般是指不编码蛋白质的一类长链RNA分子,越来越多的研究均表明lncRNA有着极其重要的调控功能,如:调控基因表达、调控DNA表观修饰、调控蛋白质活性及定位、调节其他类型的RNA等,与生物的生长发育、衰老凋亡、疾病的发生发展等有密切关系。

    2. lncRNA研究主要集中在那些方面?

    目前在人类中lncRNA研究的最多最为成熟,发现了一大批新的lncRNA,特别是在肿瘤等一些疾病中研究较为深入,有助于阐明疾病发生发展的机理,有些lncRNA可以作为疾病诊断或者预后的标记。在动植物中,lncRNA也是研究的热点,主要集中在一些常见的动植物,比如:小鼠、大鼠、斑马鱼,拟南芥、水稻、玉米等,研究内容丰富多样,包括生长发育、疾病机理、抗逆性等。

    3.lncRNA研究建库及测序方案是什么?

    由于部分lncRNA不含有polyA尾,所以采用传统的polyA+富集的方法获得RNA,会丢失部分lncRNA。因而为了最大程度的富集lncRNA,建库一般采用RiboZero Kit去除rRNA后建库,另一方面,在真核生物中,普遍存在正反义链gene同时表达的情况,为了解决这一问题,一般采用链特异方法建库,有助于确定转录方向及后续的定量分析。

    因为需要进行转录本组装,所以测序一般采用PE测序。

    4. lncRNA测序一般要多少数据量?

    从目前的研究结果来看,lncRNA表达水平普遍低于蛋白基因,通常低1~2个数量级,为了有效的检测低表达的转录本,建议测序量在5G及以上。

    5. lncRNA数据是否可以做mRNA的分析?

    采用lncRNA测序可以同时检测到mRNA,基于测序数据可以同时进行mRNA相关分析。

    6. lncRNA测序送样要求?

    同转录组;

     


    miRNA FAQ


    1. miRNA测序样本要求?

    RNA样本:一般要求浓度在200ng/μL以上,总量大于2μg;样本纯度OD260/280≥1.828S/18S≥1.5;RNA完整性:RIN≥8.0

    血浆/血清样本:血清中由于含有复杂的蛋白质、多糖等上百种成分,且大多成分至今未知,提取难度增加,提取的稳定性较差,风险相对高。请确保送样量在5 mL以上。为保证成功率,建议使用TRIzol LS Reagent  (LifeTech 公司出品)来处理用于RNA测序的体液样本。

    步骤:在得到体液之后,以比例加入TRIzol LS(例如,对于1 mL的血清,要加入3mLTRIzol LS)。用移液器吹打几次,立即混合均匀。然后把样本放在-20  或者-80保存。

    2. 为什么测序时会测到接头?

    Illumina高通量测序每条reads长度是相同的,miRNA测序长度一般为50bp左右,而miRNA长度一般在18~30nt,所以理论上,每条miRNA的末端都应该测到接头。

    3. miRNA分析时,客户需要提供哪些信息?

    需要客户提供对应物种的基因组及exonintronrepeat的注释信息。

    4.该物种没有对应的基因组序列,是否可以分析?

    如果没有分析物种的基因组序列,可以考虑近缘物种的全基因组序列,以及该物种的转录组序列作为参考,另外最好有exon/intron, repeat的注释信息。

    5. miRNA一般要求多少测序量较为理想?

    目前来看miRNA的量与物种,组织或细胞类型有直接的关系。用于测序的材料对测序数据量有着直接的影响,所以测序结果可能出现miRNA差异较大的情况。从分析的角度来看,一般miRNA测序量在10M左右的reads

    6. miRNA定量一般采用什么方法?

    miRNA一般采用TPMtags per million reads,即:每百万reads中比对到该miRNAtag数。因为测序reads可以覆盖miRNA的全长,所以每条miRNA的测序reads数至于测序量有关,与miRNA长度无关。与RPKM/FPKM不同,TPM只需要消除测序量的影响。

    7. 为什么分析结果会出现mRNArRNA以及tRNA等序列?

    在样本运输、RNA提取过程中,RNA通常会发生轻微的降解,并且在生物体内也存在自然的降解(NMD),降解的小片段会被建库测序,但是正常情况下,这个比例较低,主要受到样本和RNA质量影响。

     


    表达谱FAQ


    1. 表达谱测序量一般要求多少?

    表达谱测序主要用来对样本中基因表达水平进行定量,而不关注mRNA结构等研究,所以测序量一般要求较低,10M以上即可。

    2. 是否需要生物学重复,一般重复几次较好?

    建议2~3次,结合分析需求和预算,可以考虑更多次的重复。有研究表明,当测序量达到20M后,增加样本重复比增加测序量更能提高差异基因检测power,而且从文章发表角度看,设置生物学重复,有利于提高检测结果的准确性,增加研究结果的影响力;

    3. 无参考基因组能否进行表达谱分析?

    无参考基因组,可以使用本物种已发表或测序的转录组/EST序列,进行基因表达定量及差异分析;本物种没有任何已知基因信息,建议先进行转录组de novo测序后,再进行表达谱分析。

    4.如何进行差异表达基因后续的功能分析?

    筛选出差异表达基因后,一般会进行GOKEGG富集分析,寻找差异表达基因参与的功能及代谢、信号转导途径。蛋白网络分析,可以探究与差异表达基因互作的上下游基因。多样本表达模式聚类分析,可以找出表达模式相似的基因,这些基因常常具有相似的功能。

    5. 如何选择差异表达基因进行后续验证?

    基因选取一般基于两个原则:1)功能重要的,即基于GOKEGG富集分析结果,选取与研究目的相关的基因进行后续的验证和研究;2)差异显著的,可以结合差异倍数及P-value值,筛选特别显著的基因进行验证。

     

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