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    高通量测序服务
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      转录组测序

      转录组测序 (Transcriptome Sequencing)背景及概述转录组(Transcriptome)一般指特定状态下,细胞或组织内所有转录产物的总和,包括mRNA,rRNA,tRNA和其它非编码RNA(non-coding RNA)等。转录组是动态调节的,受内外多种因素影响,能够直接反映出不同物种、个体、细胞、发育阶段以及不同生理、病理状态下的基因表达调控信息。转录组测序是指通

      1. 详细信息

      转录组测序 (Transcriptome Sequencing)

      背景及概述

      转录组(Transcriptome)一般指特定状态下,细胞或组织内所有转录产物的总和,包括mRNArRNAtRNA和其它非编码RNAnon-coding RNA)等。转录组是动态调节的,受内外多种因素影响,能够直接反映出不同物种、个体、细胞、发育阶段以及不同生理、病理状态下的基因表达调控信息。转录组测序是指通过第二代高通量测序及信息分析,快速全面的获取几乎所有转录产物的序列及表达信息,相对于芯片有诸多优势,是基因转录调控研究的强大工具,目前已广泛应用于癌症基础研究、临床诊断以及抗癌药物研发等领域[1]

      技术参数

      产品

      策略

      推荐数据量

      周期

       

      转录组测序

      Illumina HiSeqTM 2500 PE125

      一般深度:6G Clean Data

      高深度:10G Clean Data

       

      40个工作日

      为了保证结果准确性,推荐设置生物学重复或大样本数(≥5对样本)进行研究。

      技术路线 

      各样本提取总RNA后分离出mRNA,随机片段化后反转录合成cDNA链,末端加接头后进行PCR扩增,构建Illumina测序文库,文库检测合格后,进行高通量测序,详细过程如下图所示:

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      生物信息分析服务内容

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      *基于poly(A)建库获取的lncRNA分析内

      产品优势

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      案例精解

      转录组测序鉴定前列腺癌发病机理及分子标记       

      RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicings[2] RNA-Seq测序分析前列腺癌在中国人中的复发性基因融合,长链非编码RNA以及可变剪切研究Cell  Res. 2012. IF: 12.413.

       

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                                      图 1 前列腺癌融合基因

      常见问题

      Q1:与基因芯片相比,转录组高通量测序有什么优势?

      基因芯片依赖于已知基因序列设计探针,因此无法检测未被发现的基因;另外,核酸杂交的背景噪音很高,存在非特异性杂交现象。转录组测序可以直接对样本几乎全部mRNA进行测序,不仅可以检测已知基因,还能够发现很多新的基因;测序可以实现数字化表达水平,检测范围更广,定量结果更灵敏、准确。此外,还可以分析可变剪切、碱基变异、融合基因等基因结构变异进行全面深入分析。

      Q2:针对肿瘤样本RNA提取,是否有指导性方法?

      RNA质量的好坏主要取决于样品本身的质量,即新鲜程度。Invitrogen公司的TRIzol试剂针对大多数的组织样品都能获得较好的提取效果,请客户参照其说明书进行;对于脂肪组织可采用QIAGEN公司的RNeasy Lipid Mini Kit进行提取。特殊样本请咨询相关人员。

      Q3:转录组建库过程中是用随机引物进行转录,还是用oligo(dT)做反转录?

      常规建库采用随机引物进行反转录,如有特殊要求可采用oligo(dT)或者两种都采用。

      Q4:转录组测序后有何验证方法?

      表达量可通过实时荧光定量PCRqRT-PCR)技术来验证;可变剪接、融合基因、突变等,可以通过RT-PCR结合Sanger测序进行验证。

      Q5TruSeq微量建库是什么?最低起始量可以达到多少?

      Truseq真核转录组是指通过使用Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit进行微量建库,并基于高通量测序平台快速获取mRNA信息的测序产品。目前TruSeq微量建库的起始量可达到100ng。

       

      送样要求

       

      样品类型

      细胞、新鲜组织或RNA样品。 

      样品量

      细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供10μg以上的总RNA 

      样品质量

      RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL28S:18S≥1.5RIN≥7 

      样品保存

      细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIzolRNA保护剂处理或液氮冻存后,-80保存。RNA样品可溶于RNA-Free的超纯水中,-80保存。样品保存期间避免反复冻融。 

      送样要求

      样品请置于合适大小的冻存管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50mL带盖离心管中,再将50mL管放在封口袋中。密闭的离心管内请勿放置液氮等以免温度变化引起爆裂。

      *其他类型样本:联系当地销售人员进行处理。


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