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    高通量测序服务
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      Small RNA测序

      Small RNA测序 (Small RNA Sequencing)背景及概述MicroRNA(miRNA)是一类长度为21-23nt的调控基因表达的单链非编码小RNA。MiRNA在细胞生长和发育过程中具有多种调节作用,同时在一些疾病、逆境情况下某些特定的miRNA会特异性表达。作为潜在的生物标记物,miRNA具有稳定性好等蛋白标记物无法比拟的优势。因此,从组学层次上研究和理解miRNA

      1. 详细信息

      Small RNA测序 (Small RNA Sequencing)

      背景及概述

      MicroRNAmiRNA)是一类长度为21-23nt的调控基因表达的单链非编码小RNAMiRNA在细胞生长和发育过程中具有多种调节作用,同时在一些疾病、逆境情况下某些特定的miRNA会特异性表达。作为潜在的生物标记物,miRNA具有稳定性好等蛋白标记物无法比拟的优势。因此,从组学层次上研究和理解miRNA的表达和功能具有重要意义

      技术参数

      产品

      策略

      推荐数据量

      周期

       

      Small RNA测序

       

      Illumina HiSeqTM 2500 SE50

      一般深度:8M Clean Reads

      高深度:15M Clean Reads

       

      40个工作日

      为了保证结果准确性,推荐设置重复或大样本数(≥5对样本)进行研究。

      技术路线

      样本提取总RNA后依次连接上3’接头和5’RNA接头,RT-PCR反转录成单链cDNA,进行PCR扩增,筛选长度在140-150bp的片段构建Illumina测序文库,文库检测合格后,进行高通量测序,详细过程如下图所示:

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      生物信息分析服务内容


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      产品优势

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      案例精解

      案例动物生长发育研究        Transcriptome-wide analysis of small RNA expression in early zebrafish development [16](斑马鱼发育早期过程中的small RNA表达分析RNA. 2012. IF=4.94.

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      常见问题

      Q1Small RNA的测序策略是什么?大概多少数据量够分析? 

      采用Illumina HiSeqTM 2500 SE50的策略,每个样品可以得到不少于8M的原始reads用于分析。另外,若为血清或其他特殊要求的样本,可以根据客户的需要加测数据。

      Q2Small RNA测序对RNA样品有什么要求? 

      请提供浓度≥200 ng/μL、质量≥10μg的总RNA样品。提取总RNA时请避免使用过柱法和LiCl沉淀,以防止小RNA丢失。

      Q3:血清Small RNA项目存在哪些风险?

      血清/血浆RNA或免疫共沉淀RNA等特殊样品,其RNA来源不明,含量低,有时空性,容易受到环境RNA的污染,提取方法不成熟,无法完全去除蛋白,盐分等杂质,致使样本提取困难;提取的血清RNA在样品检测时,无法测定浓度、总量以及完整度等;样品质量无法评估,建库有风险。例如样品量少,在建库过程中就必须提高PCR扩增循环数,导致出现严重的扩增偏好性,造成数据质量不稳定,重复性差等问题。这一系列的问题给信息分析造成很大的风险,导致预期实验结果合作伙伴不满意。

      Q4Small RNA测序是否需要提供参考序列?客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

      需要,最好提供所做物种的全基因组序列。如果没有,也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列。提供参考序列,需要提供相应物种的基因组和相关的 exonintronrepeat信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 

      Q5:为什么说原始数据中存在3’接头序列、5’接头序列污染是正常的? 

      目前采用的测序策略是SE50,而small RNA序列长度是18-30 nt,故测序得到的序列上有一段 3’接头序列。污染指的是5’接头分子,由于加接头时接头分子都是过量加入的,因此会有空载现象,造成数据中含有少量的5’接头序列污染。比例较小时,属于正常现象。 

      Q6:为什么实验结果中会存在mRNArRNA以及tRNA等序列? 

      在样本运输、RNA提取过程中,RNA通常会发生轻微的降解,并且在生物体内也存在自然的降解,降解的小片段会被建库测序,但是正常情况下,这个比例较低,主要受到样本和RNA质量影响,因此,small RNA测序对总RNA的完整性有一定的要求。

      Q7MiRNA定量一般采用什么方法?

      MiRNA一般采用TPMtags per million reads),即:每百万reads中比对到该miRNAtag数。因为测序reads可以覆盖miRNA的全长,所以每条miRNA的测序reads数至于测序量有关,与miRNA长度无关。与RPKM/FPKM不同,TPM只需要消除测序量的影响。

       

      送样要求

       

      样本类型

      细胞、新鲜组织或RNA样品。 

      样品量

      细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供10μg以上的总RNA 

      样品质量

      RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL28S:18S≥1.5RIN≥7 

      样品保存

      细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIzolRNA保护剂处理或液氮冻存后,-80保存。RNA样品可溶于RNA-Free的超纯水中,-80保存。样品保存期间避免反复冻融。 

      送样要求

      样品请置于合适大小的冻存管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50mL带盖离心管中,再将50mL管放在封口袋中。密闭的离心管内请勿放置液氮等以免温度变化引起爆裂。

      *其他类型样本:联系当地销售人员进行处理。


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