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    南京迪康金诺生物技术有限公司

    高通量测序服务
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      降解组测序

      降解组测序 (Degradome Sequencing)背景及概述MicroRNA(miRNA)是一类长度为21-23nt的调控基因表达的单链非编码小RNA。降解组测序(Degradome Sequencing)主要针对miRNA介导的剪切降解片段进行深度测序,从实验中筛选miRNA作用的靶基因,并结合生物信息学分析优势,确定降解片段与miRNA精确的配对信息。该技术能从细胞或组织中准确

      1. 详细信息

      降解组测序 Degradome Sequencing

      背景及概述

      MicroRNAmiRNA)是一类长度为21-23nt的调控基因表达的单链非编码小RNA。降解组测序(Degradome Sequencing)主要针对miRNA介导的剪切降解片段进行深度测序,从实验中筛选miRNA作用的靶基因,并结合生物信息学分析优势,确定降解片段与miRNA精确的配对信息。该技术能从细胞或组织中准确高效地筛选出miRNA的靶基因,为研究miRNA与其对应的靶基因的相互关系提供准确、高效的筛选手段

      技术参数

      产品

      策略

      推荐数据量

      周期

       

      降解组测序

      Illumina HiSeqTM 2500

       SE50

      一般深度:8M Clean Reads

      高深度:15M Clean Reads

       

      50个工作日

      为了保证结果准确性,推荐设置重复或大样本数(≥5对样本)进行研究。

      技术路线

      将获得的总RNA磁珠捕获得到mRNAmRNA纯化,并连接5’接头,反转录第一链的合成,PCR扩增,酶切及去磷酸化,连接3’接头,PCR扩增及产物回收纯化,文库检测合格后,进行高通量测序,详细过程如下图所示:

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      生物信息分析内容

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      产品优势

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      案例精解

      案例降解组低温胁迫研究

      Identification of chilling stress-responsive tomato microRNAs and their target genes by high-throughput sequencing and degradome analysis[19](通过高通量和降解组测序鉴定土豆中响应低温胁迫的microRNAs和靶基因BMC Genomics. 2014. IF=3.99.

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      常见问题

      Q1:降解组测序策略是什么?大概多少数据量够分析? 

      采用Illumina HiSeqTM 2500 SE50的策略,每个样品可以得到不少于8M的原始reads用于分析。另外,若为血清或其他特殊要求的样本,可以根据客户的需要加测数据。

      Q2:降解组测序对RNA样品有什么要求? 

      请提供浓度≥500 ng/μL、质量≥500μg的总RNA样品。单次文库制备用量250μg,为保证实验的顺利进行,因此需保证样品总量大于2次以上的建库用量(不包括样品检测损耗)

      Q3:降解组测序是否需要提供参考序列?客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息? 

      需要,最好提供所做物种的全基因组序列。如果没有,也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列。提供参考序列,需要提供相应物种的基因组和相关的 exonintronrepeat信息。如果没有本物种的基因组,需要提供近缘物种的相关信息。 

      Q4:为什么说原始数据中存在3’接头序列、5’接头序列污染是正常的? 

      目前采用的测序策略是SE50,而降解组序列长度是18-30 nt,故测序得到的序列上有一段 3’接头序列。污染指的是5’接头分子,由于加接头时接头分子都是过量加入的,因此会有空载现象,造成数据中含有少量的5’接头序列污染。比例较小时,属于正常现象。 

      Q5:为什么实验结果中会存在mRNArRNA以及tRNA等序列? 

      在样本运输、RNA提取过程中,RNA通常会发生轻微的降解,并且在生物体内也存在自然的降解,降解的小片段会被建库测序,但是正常情况下,这个比例较低,主要受到样本和RNA质量影响,因此,降解组测序对总 RNA的完整性有一定的要求。

       

      送样要求

       

      样品类型

      细胞、新鲜组织或RNA样品。 

      样品量

      细胞样品请提供至少1×107个细胞,组织样品请提供至少300mg的组织块或切片,RNA样品请提供10μg以上的总RNA 

      样品质量

      RNA无明显降解,提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间,浓度≥500 ng/μL28S:18S≥1.5RIN≥7 

      样品保存

      细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可用TRIzolRNA保护剂处理或液氮冻存后,-80保存。RNA样品可溶于RNA-Free的超纯水中,-80保存。样品保存期间避免反复冻融。 

      送样要求

      样品请置于合适大小的冻存管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50mL带盖离心管中,再将50mL管放在封口袋中。密闭的离心管内请勿放置液氮等以免温度变化引起爆裂。

      *其他类型样本:联系当地销售人员进行处理。


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