降解组测序

降解组测序 （Degradome Sequencing）

背景及概述

MicroRNA（miRNA）是一类长度为21-23nt的调控基因表达的单链非编码小RNA。降解组测序（Degradome Sequencing）主要针对miRNA介导的剪切降解片段进行深度测序，从实验中筛选miRNA作用的靶基因，并结合生物信息学分析优势，确定降解片段与miRNA精确的配对信息。该技术能从细胞或组织中准确高效地筛选出miRNA的靶基因，为研究miRNA与其对应的靶基因的相互关系提供准确、高效的筛选手段。

技术参数

为了保证结果准确性，推荐设置重复或大样本数（≥5对样本）进行研究。

技术路线

将获得的总RNA磁珠捕获得到mRNA，mRNA纯化，并连接5’接头，反转录第一链的合成，PCR扩增，酶切及去磷酸化，连接3’接头，PCR扩增及产物回收纯化，文库检测合格后，进行高通量测序，详细过程如下图所示：

生物信息分析内容

产品优势

案例精解

案例1 降解组低温胁迫研究

Identification of chilling stress-responsive tomato microRNAs and their target genes by high-throughput sequencing and degradome analysis^[19]（通过高通量和降解组测序鉴定土豆中响应低温胁迫的microRNAs和靶基因. BMC Genomics. 2014. IF=3.99.）

常见问题

Q1：降解组测序策略是什么？大概多少数据量够分析？ 

采用Illumina HiSeq^TM 2500 SE50的策略，每个样品可以得到不少于8M的原始reads用于分析。另外，若为血清或其他特殊要求的样本，可以根据客户的需要加测数据。

Q2：降解组测序对RNA样品有什么要求？ 

请提供浓度≥500 ng/μL、质量≥500μg的总RNA样品。单次文库制备用量250μg，为保证实验的顺利进行，因此需保证样品总量大于2次以上的建库用量(不包括样品检测损耗)。

Q3：降解组测序是否需要提供参考序列？客户除了样品以外还需要提供哪些相关信息？ 

需要，最好提供所做物种的全基因组序列。如果没有，也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列。提供参考序列，需要提供相应物种的基因组和相关的 exon、intron、repeat信息。如果没有本物种的基因组，需要提供近缘物种的相关信息。 

Q4：为什么说原始数据中存在3’接头序列、5’接头序列污染是正常的？ 

目前采用的测序策略是SE50，而降解组序列长度是18-30 nt，故测序得到的序列上有一段 3’接头序列。污染指的是5’接头分子，由于加接头时接头分子都是过量加入的，因此会有空载现象，造成数据中含有少量的5’接头序列污染。比例较小时，属于正常现象。 

Q5：为什么实验结果中会存在mRNA、rRNA以及tRNA等序列？ 

在样本运输、RNA提取过程中，RNA通常会发生轻微的降解，并且在生物体内也存在自然的降解，降解的小片段会被建库测序，但是正常情况下，这个比例较低，主要受到样本和RNA质量影响，因此，降解组测序对总 RNA的完整性有一定的要求。

送样要求

样品类型

细胞、新鲜组织或RNA样品。 

样品量

细胞样品请提供至少1×10⁷个细胞，组织样品请提供至少300mg的组织块或切片，RNA样品请提供10μg以上的总RNA。 

样品质量

RNA无明显降解，提取的总RNA OD260/280值在1.8~2.2之间，浓度≥500 ng/μL，28S:18S≥1.5，RIN≥7。 

样品保存

细胞样品或新鲜组织块（切成~50mg的小块）可用TRIzol或RNA保护剂处理或液氮冻存后，-80℃保存。RNA样品可溶于RNA-Free的超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。 

送样要求

样品请置于合适大小的冻存管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50mL带盖离心管中，再将50mL管放在封口袋中。密闭的离心管内请勿放置液氮等以免温度变化引起爆裂。

*其他类型样本：联系当地销售人员进行处理。