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    荧光定量PCR服务

    荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,目前在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用;另外,荧光定量PCR技术正以无可比拟的优势取代Nort

    1. 详细信息

    荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,目前在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用;另外,荧光定量PCR技术正以无可比拟的优势取代Northern杂交成为mRNA定量的金标准。本公司提供全套的荧光定量PCR服务,愿成为您科研工作的强有力支持。

     

    一、技术简介

    一般而言,荧光PCR扩增曲线可以分三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期 。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在明显线性关系,我们选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,在本实验中荧光阈值是通过软件自动优化选择的。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明,每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,其中横坐标代表CT值,纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

    我们采用标准曲线法进行相对定量实验。在此方法中,目的基因的量是相对于某个样本的量而言的,所以对该样本进行梯度稀释,制作出标准曲线。其他样本的量都来自于标准曲线,通过阳性内参校正后,再除以该样本的量就可以得到目的基因的相对定量结果。我们采用的检测方法是SYBR Green I嵌合荧光法或TaqMan探针法。

     

    二、服务流程

    1、 样本cDNA的制备,如果原始样品为组织,细胞或其他生物样品,则还包括样本RNA的提取、纯化、质量检测等;

    2、引物设计合成;

    3、PCR条件摸索:使用设计合成的引物,以客户提供样本的cDNA为模板,进行RT-PCR反应,确认引物模板的反应性能。改变退火温度和Mg2+浓度等以达到最佳PCR反应条件。

    4、Real Time PCR反应及定量分析:对客户提供的样本进行Real Time PCR反应,并定量分析。选取一个样本进行3个浓度梯度稀释,每个浓度梯度做3管重复,制作标准曲线,根据标准曲线计算出其他样本的相对量。用相对定量方法进行定量分析时,要对管家基因进行同样操作,用所得到的值进行RNA量的校正,最后求得目的基因的相对表达量。

    图片关键词

    ABI 7500实时荧光定量PCR仪

     

    三、操作程序

    1、您提供待需要定量的mRNA或DNA的相关材料,共同探讨服务的可能性和技术路线。

    2、签订技术服务合同,商定服务收费、任务期限等。您需要预付实验总费用的60%作为实验预付款。 

    3、由您提供实验所需的足够量的样品(100mg组织块或107个细胞);如果为RNA/DNA样品,则需要提供其质量检测报告并证明其能够达到后续试验的需求,我们再根据您提供的要检测的RNA或DNA的序列设计、合成荧光探针。

    4、进行RNA的抽提、RNA定量、反转录、荧光定量PCR反应。 提供实验报告、定量结果及彩图等(我们提供的均为客观的原始数据,不对这些数据的意义做统计分析)。  

     

    四、其他说明

    1、服务说明:

    关于报价:我们将根据您具体的实验情况(绝对、相对定量、染料法、探针法和样本数量)给出不同的报价方案和优惠政策。

    2、报告内容:样品质检报告、定量结果报告(扩增反应报告、溶解曲线报告和荧光定量数据结果及基柱状图)

    3、增值服务:除了前期和客户积极沟通,对实验设计提出良好的建议外,后期如果客户对实验和结果有疑惑,我们将对您进行报告解读服务和实验讨论,一如既往的为您提供优质服务。


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